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层析柱装柱、使用及相关注意事项

关于层析柱装柱、使用及相关注意事项

（1）、装柱前要仔细看填料的使用说明书，每种填料都有自己的特性，以及特殊的装柱方法，针对不同的空柱，也要注意方法可能不同；这一点非常重要：装柱包括以后使用中不允许柱内进入气泡（bubble free），柱头事先也要排除气泡。

（2）、填料要加水搅拌成均匀悬液，悬液浓度依填料而不同，一般70－85%，迅速倒入空柱内，或吸或压，流速和具体步骤看说明书。

（3）、所有柱子尽量做到填料均匀，尤其是用于凝胶层析的柱子。装柱完成后，可用柱效测定的方法检查装填效果。一个装填合格的柱子的理论塔板高度应是填料平均粒径的2－4 倍，在此范围内越小越好。

（4）、选择合适的泵，**是流速满足要求，脉冲尽量小。柱塞泵。

（5）、准备上柱的液体应进行过滤，至少是0.45micrometre。

（6）、关于纯化，**要考虑的是你的目标：纯度、数量、速度、收率等等，再根据样品的具体情况，树脂柱多少钱，尤其是目标蛋白的性质，确定纯化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。*步先从大量或复杂样品中将目标蛋白%26ldquo;抓出%26rdquo;，与主要杂质分离；再用高选择性的层析去除绝大部分杂质；后精细纯化，提供纯度至设定目标。到实际工作中，不要死靠三步，也许一步也许四步或更多，具体情况具体分析。所谓%26ldquo;三步%26rdquo;只是一种思路而已。

（7）、至于测序，我想大概不到1mg 应该足够了。

大孔吸附树脂应用过程中，需要注意一些问题

在大孔吸附树脂的应用过程中，也需要注意一些问题:

①储存与运输的过程中，要防止树脂脱水或受冻而被破坏;

②使用前应按照一定的步骤进行预处理，以去除树脂内可能含有的分散剂、致孔剂、惰性溶剂等化学残留;

③在树脂装柱运行后，可能有堵塞发生，造成的原因主要有悬浮物污堵、生物

堵塞、铁及镁污染和硫酸钙沉淀，应采用相应的处理措施将堵塞物去除;

④脱附工艺中会产生碱性脱附液，需要进一步处理。

一文了解亲和层析柱装柱注意事项

后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择NAD 进行洗脱，树脂柱价格，NAD 是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD 结合而从配体上脱离。

特异性洗脱方法的优点是特异性强，树脂柱供应，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。

另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。

由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，树脂柱，可以通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。

　　

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