细胞实验 南京英瀚斯生物科技 细胞实验外包

三、自噬过程进行观察和检测

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜，细胞实验外包费用，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，细胞实验外包选哪家，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring) 自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽，细胞实验，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 细胞/孔接种 6 孔板 (或 35 mm 培养皿) 培养 24 小时，使其达到 50～60% 板底面积。

(2) 在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下：

①在 1 mL 无 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。

②旋转 1 秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

③室温下放置 5～10 分钟，使 DNA 结合在脂质体上。

(3) 弃去细胞中的旧液，用 1 mL 无 DMEM 洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂质体复合物，37℃ 培养 3～5 小时。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，继续培养 14～24 小时，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM，2 mL/孔，再培养 24～48 小时。

(6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下：

(1) 接种细胞同前，细胞实验外包，细胞长至 50% 板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2)、(3) 步骤。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM，37℃ 培养 48 小时。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染，方法参照细胞筛选法进行。

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯ji)-3-(4-硝ji苯ji)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓硫酸二jia酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活xi胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。




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