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- 2023-04-05 04:31:22
细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡
流式细胞术检测细胞周期：
细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，河北细胞实验，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，细胞实验外包，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。
细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。
一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。
结果示例：
图 A 细胞周期检测图；B 细胞凋亡检测图
细胞冻存有哪些注意事项？
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。
细胞冻存的步骤：
配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;
取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。
去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;
离心 1000rpm，5min;
去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞实验外包公司，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;
将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;
在冻存管上标明细胞的名称，细胞实验外包哪家好，冻存时间及操作者;
冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
细胞培养中常见的污染及解决方法
黑点污染
黑色的游动点能穿透滤膜并在空气中扩散。它们在低倍镜下显示为黑色圆点，在高倍镜下显示为可移动的黑点。培养液也不浑浊，一般影响较小，因此细胞仍可使用。通常，黑点污染后，细胞生长良好，运动物体无明显增加，培养基的颜色和透明度无明显变化。在同一批培养的细胞中也可以发现类似的现象。
解决方法：黑点对细胞生长状态没有明显影响，细胞增殖后会自然消失，因此除了置换外，无需特殊处理。如果细胞可能被小的运动点污染，建议增加培养皿细胞密度，以提高细胞存活率。