PMA-EMA-qPCR染料吸附交联仪

PCR染料吸附交联仪

光解仪：是一种轻质 LED辐照设备，设计用于在活性检测 PCR 应用中对PMA及其他光反应染料进行控制时间和温度的光处理。现在已经有越来越多的文献报道采用了PMA-PCR或PMA-qPCR等方法对样本中的活细胞进行定性或定量分析。

适用于细菌，病毒，真菌的PCR分析，结合DNA,交联等。样本还包括生物膜，酵母，真核细胞，应用食品、水安全和环境测试。

叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide，PMA）是一种光反应的DNA结合染料，用于微生物（比如：细菌、病毒和真菌）的活力PCR（v-PCR）分析。作为一种DNA修饰剂和光反应染料，PMA高亲和结合DNA。经可见光刺激发生光裂解后，PMA共价吸附到DNA上，这一改性的DNA不能被PCR扩增。PMA染料不具细胞膜渗透性，在含活死细胞的群体内，只有死细胞对DNA修饰剂敏感，由于具受损的细胞膜。PMA染料的这一特性，使其高度适合通过PCR的手段来选择性检测活细菌。

叠氮溴化丙锭（Propidium Monoazide，PMA）具有以下特征：①利用PCR技术选择性检测活细胞；②死细胞特异性染料，结合到DNA上；③光活化后共价交联到DNA上；④适用于多种样本类型包括：细菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞；能应用在食品和水安全和环境测试，能与PCR、NGS、Sanger测序和LAMP技术结合使用。

叠氮溴化乙锭（Ethidium Monoazide Bromide，EMA）是一种具光亲和标记特性的荧光核酸染料。EMA经光分解后，能共价结合到溶液和损伤的细胞核酸上。此染料能用来印记DNA上的药物结合位点，检测死细胞，鉴定DNA和tRNA上的乙锭结合位点和选择性失活基因表达。EMA特殊的用途是标记死活细胞群内的死细胞，因其相对来说不具有细胞膜渗透性，则选择性结合死细胞的DNA。EMA还能通过5′核酸酶PCR来区分死细菌和活细菌。EMA本身荧光较弱，当与DNA结合后荧光增强约15倍，大激发/发射波长约510/600nm。

厌氧消化是一种非常高效的污水处理方法，若想维持厌氧消化池的正常运作，就必须了解参与消化的微生物种群。PMA必不可少。

乳制品在游牧民族中是一类颇受欢迎的食品，而发酵类乳制品中的微生物，尤其是乳酸菌，能够提高乳制品的外观和口感。对比PMA处理的结果和传统培养法的结果，使用PMA处理的方法可以检测到一些使用培养法检测不到的痕量微生物，如清酒乳杆菌和肠膜明串珠菌。

产品特点：

1. 工作电压：AC220V/50Hz

2. 标配1.5ml/2ml离心反应管

3. 一次可允许18管或者32管样品照明

4. 内风扇确保温度低于37度

5. 照明时间自由设定：1-999分钟

6. LED光波长465-475nm

7. 用途：可有效地激活PMA, PMAxx, EMA和相似的染料

技术参数：

尺寸 21 x 15.9 x 6.7 厘米

重量 1.85 千克

频率范围 50~60 Hz

电压范围 220 VAC

大功率 60 W

LED输出波长 465-475 nm

可以另配： 120/240 V 转换器，用于国外接口。

应用案例：

弧菌(vibrio)是水产品中为常见的致病菌，副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)是主要水产源致病菌，由该菌引起的食物中毒事件居细菌性食物中毒事件的首位，也被视为范围内导致腹泻类疾病的为主要因素之一。霍乱弧菌(vibrio cholerae)是导致人体产生霍乱疾病的主要源头，流行广泛且属于烈性传染病之一，曾多次引起大面积的疾病，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，严重的可导致死亡，如何快速、和高效地检测水产品中致病弧菌具有重要意义。

传统定量检测食品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法通常需要1周时间，基于DNA的 qPCR定量技术虽简便快捷，但无法区分样品中死菌和活菌，容易导致假阳性现象。光敏型核酸染料叠氮溴化丙锭(PMA)与qPCR技术相结合，可以选择性地识别水产品中的活菌DNA，可用于进行活菌定量检测。PMA前处理包括暗处理和光交联两个关键步骤，传统的 PMA前处理方法通常在一个密闭的环境进行暗处理，手持600w左右的钠钨灯进行光交联，过程繁琐，全程人工操作费时耗力；基于蓝光led的光交联仪器PMA-EMA-LED32光解仪可大大简化pma前处理过程。

活性聚合酶链反应

活性PCR是一种强大的技术，用于灵敏和快速地检测活微生物。与耗时的培养方法不同，PCR 是一种快速灵敏的检测方法。正常的PCR不能区分活细胞和死细胞。使用PMA 的 v-PCR，您可以获得 PCR 的速度、灵敏度和特异性，以及可量化的活力。由于无需培养，您甚至可以检测活菌但不可培养 （VBNC） 细菌。v-PCR 技术不仅可以应用于细菌，还可以应用于酵母、病毒、真核生物和古细菌等其他生物。

光谱图：

PMA 对死细菌DNA 的共价结合效率受到多种因素的影响，主要因素有细菌种类、菌液浓度、PMA 浓度和曝光时间等。PMA 浓度和曝光时间的选择在于:PMA 浓度过低或曝光时间过短则不能充分结合和修饰死细菌的DNA; 而PMA 浓度高到一定程度则会有不容忽视数量的PMA 分子渗透进活细菌细胞内，长的曝光时间将增强其对活菌DNA 的结合和修饰作用。采用PMA-qPCR 对某一研究体系中特定活细菌进行走量检测时，往往先在固定的纯菌浓度下探究佳的PMA 处理浓度和曝光时间，之后用于实际从而达到更高的准确率。

PMA -qPCR ~t菌检测方法的建立与应用

(1)制备细菌悬液:培养好纯菌后，适当稀释到一定浓度(如OD600=1，即经过稀释使得在600nm 下的吸光值为1)，取若干份等体积的菌，其中一半采用加热和超声处理结合制备死菌样品，而一半不做处理为活菌样品;

(2) PMA 处理:在不同的PMA 浓度和曝光时间下处理(1)中的活菌组和死菌组样品;

(3) qPCR 扩增和数据分析:提取(2) 中经PMA 处理的样品的基因组DNA ，以此为模板采用该细菌特异性的qPCR 引物进行扩增，得到各组的Ct 值(qPCR 荧光阔值同扩增曲线交点对应的循环数)综合分析选出佳的PMA 处理条件。低的PMA 浓度和曝光时间为死细菌组Ct 值稳定时(即不随PMA 浓度和曝光时间的增加而发生显著的增高，如Ct 值增量不超过1)的处理浓度和时间，高的PMA 浓度和曝光时间为活细菌Ct 稳定时的处理浓度和时间;而佳的PMA 处理条件则在高和低的PMA 浓度和曝光时间之间的实际处理条件中择优选定，这样在保证充分抑制死细菌DNA 扩增的又不会影响到活细菌DNA 的扩增。

PMA 是一种高亲和性的 DNA 结合染料，该染料本身具有微弱的荧光，但与核酸结合后可以发出更为明亮的荧光。它尤其与双链 DNA 具有高亲和性。PMA 不具有细胞膜渗透性，可选择性地修饰膜受损的死细胞的 DNA。PMA 修饰的 DNA 经蓝光 (~464 nm) 光解后，PMA 上的光反应性叠氮基转化为高反应性氮烯自由基，与 DNA 结合位点附近的任何烃部分反应形成稳定的共价氮碳键，从而导致性 DNA 修饰。该修饰过程会使 DNA 不溶，并使其在随后的基因组 DNA 提取过程中与细胞碎片一起丢失，进而阻碍死细胞中目标 DNA 的 PCR 扩增。残留在溶液中未结合的 PMA，在强光照射下与水分子反应分解成无交联活性的羟胺化合物，使羟胺不再能够共价结合 DNA，从而不影响 PCR 扩增。这个特性使得 PMA 可以通过实时定量 PCR (qPCR) 的手段，检测多种样本类型包括：细菌、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞；与 qPCR、NGS、Sanger 测序 LAMP 技术相结合，广泛应用在食品和水安全和环境测试中。

一、PMA 染料：区分死活细胞的核心机制膜通透性的选择性标记

PMA（叠氮溴化丙锭）仅能穿透死细胞破损的细胞膜，与死细胞 DNA 结合并经蓝光激活后形成不可逆的共价交联。这一特性从源头消除了死细胞 DNA 对活菌检测的干扰，解决了传统 qPCR 无法区分死活细胞的痛点。例如，在热灭活的大肠杆菌样本中，PMA 处理可使死细胞 DNA 的扩增信号（Ct 值）显著升高（dCt＞4），而活细胞 DNA 的 Ct 值不受影响（dCt≈0±1）。

光解后 DNA 的高效沉淀

PMA-DNA 复合物在光解后变得不溶，可在 DNA 提取过程中与细胞碎片一同去除，进一步降低背景干扰。这一机制确保 qPCR 反应中仅活菌 DNA 被有效扩增，样本中死细胞 DNA 含量极高（如灭菌处理后的环境样本），也能通过 PMA 处理实现特异性检测。

二、SYBR Green 染料：高灵敏度定量与兼容性保障

实时荧光监测与宽线性范围

SYBR Green 通过嵌入双链 DNA 发出荧光，随 PCR 扩增动态累积信号，可实现10¹~10⁹ CFU/mL的线性定量。例如，在食品样本中，大肠杆菌活菌浓度低至 10 CFU/mL，仍能通过荧光信号的指数增长检出，灵敏度远超依赖活菌增殖的传统培养法（通常需 10³ CFU/mL 以上）。

与 PMA 处理的协同增效

SYBR Green 对 PMA 处理后的样本兼容性，其荧光信号不受 PMA-DNA 交联的影响，且对 Taq 酶活性抑制极低，确保扩增效率和定量准确性。例如，在 PMA 处理后的混合样本中，SYBR Green 仅检测活菌 DNA，而死细胞 DNA 因 PMA 的共价修饰无法被扩增，从而避免假阳性。

三、uidA 引物：靶向大肠杆菌的特异性增强

种属特异性的分子标签

uidA 基因编码 β- 葡萄糖醛酸酶，是大肠杆菌的标志性基因。中预设计的 uidA 引物（如 5’-CGGTGATATCGTCCACCCAG-3’）经过严格验证，仅扩增大肠杆菌 DNA，对沙门氏菌、志贺氏菌等近缘菌无交叉反应。例如，在多重 PCR 实验中，uidA 引物可鉴别大肠杆菌，而其他菌毛基因（如 K88、K99）的引物互不干扰。

预优化的扩增效率

引物浓度（0.5 μM）、退火温度（60-65℃）等参数已在中预先优化，减少了用户自行设计和验证引物的时间成本。例如，在不对称 PCR 体系中，uidA 引物的佳上下游比例为 1:3，可显著提高单链 DNA 的产量，适用于免疫层析等下游应用。

四、实验流程的便捷性与灵活性

一站式预混体系

包含 PMA 染料、SYBR Green qPCR Mix 及 uidA 引物的预混体系，实验时仅需加入样本即可反应，避免了多步试剂配制的误差。例如，在食品检测中，用户无需额外购买引物或优化反应条件，4-6 小时即可完成从样本处理到定量的全流程。

适配复杂样本的高兼容性

样本类型广泛：适用于食品（如米线、蔬菜）、环境（土壤、水体）及临床样本（粪便、组织），对紫外线灭活、化学消毒等处理后的样本仍有效。

基质干扰可控：针对粪便、土壤等复杂样本，提供了优化建议（如稀释度调整、光解时间延长），确保在高背景干扰下仍能准确检测。

验证体系的标准化

提供活 / 死菌对照及 dCt 计算方法，用户可通过对比处理组与未处理组的 Ct 值，快速验证 PMA 处理效果及实验可靠性。例如，在大肠杆菌灭活实验中，dCt＞4 表明 PMA 成功抑制了 94% 以上的死细胞 DNA 扩增。

五、核心价值与典型应用场景

1.食品安全与公共卫生

快速筛查致病菌：在食品加工环节（如乳制品、即食蔬菜）中，可快速检测大肠杆菌活菌，避免因死菌残留导致的假阳性报告。

灭菌效果评估：通过对比 PMA 处理前后的 Ct 值，量化消毒剂（如精油、紫外线）对大肠杆菌的灭活效率，为工艺优化提供数据支持。

2.环境监测与微生物生态学

水体污染预警：在饮用水或地表水中，结合 uidA 引物的特异性，可追踪大肠杆菌活菌的时空分布，评估水体健康状况。

菌群活性分析：在土壤或堆肥样本中，区分功能菌（如固氮菌）的死活状态，研究微生物群落的动态变化。

3.临床与科研

感染性疾病诊断：在粪便样本中定量大肠杆菌活菌载量，辅助肠道感染的诊疗。

抗生素药敏测试：通过 PMA-qPCR 快速评估抗生素对大肠杆菌的杀菌效果，缩短药敏报告时间。

PMA qPCR 活菌检测（E.coli uidA Primer）通过PMA 的死活区分 + SYBR Green 的定量 + uidA 引物的特异性三重技术协同，实现了大肠杆菌活菌检测的性、高效性与易用性。其核心优势不仅体现在技术指标的突破（如灵敏度、特异性），更在于为食品工业、环境监测等领域提供了标准化、可追溯的检测解决方案，推动了微生物活菌检测技术的革新与应用落地。