汉坦病毒检测方法GB/T 14926.19-2001标准检测，GB/T 14926.19-2001第三方检测机构

GB/T 《实验动物 汉坦病毒检测方法》规定了汉坦病毒（HV）的检测方法、试剂等，适用于小鼠、大鼠汉坦病毒的检测。以下是该标准的核心内容：

该标准规定了两种血清学检测方法：酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：

原理：根据免疫学原理，采用HV抗原检测小鼠、大鼠血清中HV抗体。

操作步骤：包括包被抗原、封闭、加样、孵育、洗涤、加酶标二抗、显色、终止反应等步骤。

结果判定：用酶标仪测定吸光值，根据吸光值判断样本是否为阳性。

免疫荧光试验（IFA）：

原理：采用HV抗原检测小鼠、大鼠血清中HV抗体。抗原抗体反应后，加入荧光素标记的二抗，通过荧光显微镜观察荧光信号来判断是否感染。

操作步骤：包括抗原片准备、加样、孵育、洗涤、加荧光标记二抗、洗涤、荧光显微镜下观察等步骤。

结果判定：在荧光显微镜下以荧光的有无和强弱判定结果。

ELISA抗原：

特异性抗原：在生物安全柜内，用Hantaan型或Seoul型毒株感染的E6细胞，当特异性荧光达十十十时，即可收获培养物。冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液再经超速离心浓缩后制成ELISA抗原。

正常抗原：E6细胞冻融破碎后，经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液。

抗原片：在生物安全柜内，用Hantaan型或Seoul型毒株感染E6细胞，每2~3d更换维持液，培养7~10d，用IFA法测定细胞内特异性荧光。当荧光达十十十时，将细胞用胰酶分散，用PBS洗涤，涂片。室温干燥的在紫外线下20cm处照射30min，冷固定10min，-20℃保存。

阳性血清：用β丙内脂灭活HV抗原，免疫清洁或SPF小鼠或大鼠所获得的抗血清。

阴性血清：清洁或SPF小鼠或大鼠血清。

酶结合物：辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗体。用于检测相应动物血清抗体；辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A（SPA），用于检测小鼠血清抗体。

异硫氰酸荧光素标记羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗体：用于检测相应动物血清抗体。

试验有效性：阳性对照孔OD值平均值应≥1.00，阴性对照孔OD值平均值应≤0.15。若不满足此条件，试验无效。

临界值计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15。

结果判定：

若样品OD值临界值，样品为阳性。

复检：对阳性检测结果，应选用同一种方法或另一种方法重试。如仍为阳性则判为阳性。