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- 武汉纽斯特生物技术有限公司
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- 发布时间
- 2020-11-22 18:11:01
分析原理
基于构型特异性抗Gα13-GTP的NewEast生物科学Gα13活化检测试剂盒从细胞提取物或体外检测活性Gα13-GTP水平的单克l隆抗l体GTPγS负载Gα13活化试验。简单地说，抗活性Gα13小鼠单克l隆抗l体用含有Gα13-GTP的细胞裂解液培养。结合的活性Gα13将被蛋白质A/G琼脂糖。用兔抗α13多克l隆抗l体免l疫印迹法检测沉淀的活性Gα13。
武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在中国的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等。
悬浮细胞
1.培养细胞并根据需要用活化剂或抑制l剂刺激。
2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。
3.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤两次。
4.完全除去PBS洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解缓冲液
（每1 x 107池0.5 – 1 mL）。
5.通过重复移液裂解细胞。
6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。
7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这
发生时，裂解液可通过27?号注射l器针头3-4次以剪切
基因组DNA。
8.通过离心10分钟（在4°C下为12，000 x g）清除裂解物。
9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-
70°C以备将来使用。
阳性和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量
注意：体内刺激细胞会激l活大约10％的可用Rab35，而
体外GTPγS蛋白负载将激l活近90％的Rab35。
1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Rab35蛋白）。
2.向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM终浓度）。
3.将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，Rap1 蛋白，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。
4.在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。
5.在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。
6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。
试剂制备
1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mM PMSF， 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。
样品处理
贴壁细胞
1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制l剂进行处理。
2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。
3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL）。
4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。
5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27?的注射l器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。
8. 4°C 12000 g， 离心10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。