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- 发布时间
- 2023-04-04 16:03:27
三、自噬过程进行观察和检测
1、观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，流式细胞检测，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2 )的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo AV )
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring) 自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时，流式细胞，GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)
4、MDC (Monodansylcadaverine ，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
成纤维细胞分离方法
1.处死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外- -组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出，后用第三组剪刀和镊子将小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。
2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，细胞培养技术，然后将胚胎转移到另- -装有D-PBS的平皿中，天津细胞，并用手术刀片将其细细切碎。
3. 用200 μ的移液反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15 ml离心管中，于4C 1500 rpm离心5分钟，倒掉上清，以10 ml胰酶重悬沉淀，放在37C水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。
4.将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500 rpm离心5分钟收集细胞，再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
5.细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(- -般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中，接种到200 ml培养瓶中。
7. 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
8.细胞长满后，先用D-PBS冲洗，倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长，作者- -般不超过五分钟)，按1:5传代。
9. 细胞再次长到覆盖率80-90%左右， 将其消化后，常规冻存(冻存液要现配)。
关于细胞培养的常见问题
Q：培养液到底要不要加双抗（青amp;链）？
A：双抗不是细胞生长必需的。我们培养细胞时不常规使用，因为连续使用会促进耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将从培养液中去除，这种轻度污染终将发展成为大规模污染。具体情况，可根据自己实验室的环境，自行决定是否使用双抗。
Q：细胞培养，能更换成其它种类的培养基吗？
A：我们强烈建议好使用细胞提供机构或细胞库推荐的生长培养液。有些细胞可能会适应在不同培养基中生长，在做好保种的条件下，可以分出部分细胞做测试。