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- 2026-08-21 08:32:23
GB/T 标准中6.2部分详细规定了酶联免疫吸附试验（ELISA）作为实验动物支原体检测的推荐方法，以下是对该方法的详细介绍：
一、原理动物感染支原体后血清中可产生相应抗体，使用ELISA法可进行抗体检测。但由于动物自然感染后血清抗体水平较低，亦有可能因与其他病原微生物存在共同抗原而导致的交叉反应，故血清学方法仅作为初步检测的选用方法。
二、主要设备和材料酶标仪：用于检测ELISA反应的颜色变化，读取490nm处的吸光值。
普通恒温培养箱：用于微生物培养。
实体显微镜：用于观察和鉴定菌落形态。
聚苯乙烯板：40孔、55孔或96孔（可拆或不可拆），用前洗净晾干，紫外光照射1小时。
微量加样器：容量5~50μL和50~200μL。
三、培养基和试剂ELISA抗原：
支原体培养：肺支原体、关节支原体和溶神经支原体标准株接种支原体液体培养基，36℃摇动培养2~3天。
已明显混浊的培养液按8000r/min离心30分钟，沉淀用PBS在相同条件下洗3次。
上述沉淀用PBS悬浮，超声波打碎后，上清即为ELISA抗原。
酶结合物：辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗体，用于检测相应动物血清抗体；辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A（SPA），用于检测小鼠血清抗体。
阳性血清：支原体抗原免疫清洁级或SPF级小鼠或大鼠所获得的抗血清。
阴性血清：无支原体感染的清洁级或SPF级小鼠和大鼠血清。
其他试剂溶液：配制方法见相关标准。
四、检测步骤包被抗原：根据滴定的最适工作浓度，将抗原用包被液稀释。
洗涤：用洗涤液洗5次，每次3分钟，叩干。
加样：待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1:40稀释，每孔100μL，37℃孵育1小时，洗涤同上。
加酶结合物：用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度，每孔加入100μL，37℃孵育1小时，洗涤同上。
加底物溶液：每孔加入新配制的底物溶液100μL，置37℃避光显色10~15分钟。
终止反应：每孔加入终止液50μL。
测A值：在酶标仪上，于490nm处读出各孔A值。
五、结果判定在阴性和阳性血清对照成立的条件下，进行结果判定：
阳性：符合下列2个条件者，判为阳性。
待检血清的A值≥0.2。
待检血清的A值与阴性对照血清的A值之比≥2.1。
阴性：均不符合上述2个条件者，判为阴性。
可疑：仅有1条符合者，判为可疑，需重试。
阳性确认：对阳性结果需重试，如为阳性则判为阳性。