鼠痘病毒检测方法GB/T 14926.20-2001第三方检测机构，GB/T 14926.20-2001标准检测

GB/T 《实验动物 鼠痘病毒检测方法》规定了鼠痘病毒（Ect）的检测方法、试剂等，适用于小鼠Ect的检测。以下是该标准的核心内容：

酶联免疫吸附试验（ELISA）

原理：根据免疫学原理，采用Ect抗原检测小鼠血清中Ect抗体。

操作步骤：包括包被抗原、封闭、加样、孵育、洗涤、加酶标二抗、显色、终止反应等步骤。

结果判定：用酶标仪测定吸光值，根据吸光值判断样本是否为阳性。

免疫荧光试验（IFA）

原理：采用Ect抗原检测小鼠血清中Ect抗体。抗原抗体反应后，加入荧光素标记的二抗，通过荧光显微镜观察荧光信号来判断是否感染。

操作步骤：包括抗原片准备、加样、孵育、洗涤、加荧光标记二抗、洗涤、荧光显微镜下观察等步骤。

结果判定：在荧光显微镜下以荧光的有无和强弱判定结果。

免疫酶试验（IEA）

原理：与ELISA类似，也是基于抗原抗体反应的特异性进行检测。

操作步骤：包括抗原准备、加样、孵育、洗涤、加酶标抗体、显色等步骤。

结果判定：通过观察颜色反应判断样本是否为阳性。

免疫酶组织化学法

原理：用已知Ect抗体检测小鼠组织中的Ect抗原。

操作步骤：包括组织切片准备、加抗体、孵育、洗涤、加酶标二抗、显色等步骤。

结果判定：通过观察组织切片中的颜色反应判断样本是否为阳性。

ELISA抗原：用Ect感染BHK21细胞，当病变达+++～++++时收获。冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液再经超速离心浓缩后制成ELISA抗原。

抗原片：Ect感染BHK21细胞，接种后2~3d，病变达++～+++时用胰酶消化分散，PBS洗涤，涂片。室温干燥后，冷固定10min，-20℃保存。

阳性血清：用β-丙内脂灭活Ect抗原，免疫清洁或SPF小鼠所获得的抗血清。

阴性血清：清洁或SPF小鼠血清。

酶结合物：辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠IgG抗体；或辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A（SPA）。

异硫氰酸荧光素标记羊或兔抗小鼠IgG抗体：用于检测相应动物血清抗体。

试验有效性：阳性对照孔OD值平均值应≥1.00，阴性对照孔OD值平均值应≤0.15。若不满足此条件，试验无效。

临界值计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15。

结果判定：

若样品OD值临界值，样品为阳性。

复检：对阳性检测结果，应选用同一种方法或另一种方法重试。如仍为阳性则判为阳性。