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- 2026-08-21 08:32:47
GB/T 标准中4.2部分主要规定了酶联免疫吸附试验（ELISA）作为弓形虫检测的推荐方法之一，其核心内容及操作要点如下：
一、检测原理ELISA基于抗原-抗体特异性结合反应，通过酶标记的抗体与弓形虫特异性抗原结合，形成抗原-抗体复合物。加入底物后，酶催化底物显色，颜色深浅与抗体含量成正比，从而间接检测血清中弓形虫抗体的存在。
二、操作步骤包被抗原
将特异性抗原（如弓形虫RH株速殖子可溶性抗原）和正常抗原（对照）用包被液稀释至最适工作浓度。
每孔加入100μL，37℃孵育2小时后，4℃过夜保存。
洗涤
用洗涤液（含0.05% Tween-20的PBS）洗板5次，每次3分钟，拍干。
加样
血清采集：小鼠、大鼠、地鼠通过眶静脉窦采血；豚鼠心脏采血；兔耳部采血；犬和猴后肢静脉采血。
血清处理：凝血试管斜放4℃静置2小时，吸取血清转移至新试管，56℃水浴灭活30分钟。
稀释血清：用稀释液（含1%牛血清白蛋白的PBS）将待检血清1:20稀释，每孔加入100μL（特异性抗原孔和正常抗原孔各一孔），设置阴性、阳性对照血清和空白对照。
孵育：37℃孵育1-1.5小时后洗涤。
加酶结合物
用稀释液将酶结合物（如辣根过氧化物酶标记的抗动物IgG抗体）稀释至适当浓度，每孔加入100μL。
37℃孵育1-1.5小时后洗涤。
加底物溶液
每孔加入新配制的底物溶液（如邻苯二胺-）100μL，室温避光显色5-10分钟。
终止反应
每孔加入终止液（2mol/L）50μL。
测吸光度（A值）
在酶标仪上于490nm波长处读取各孔A值。
三、结果判定在对照系统（阴性血清对照、阳性血清对照、空白对照）成立的条件下，满足以下3个条件者判为阳性：
待检血清与正常抗原和特异性抗原反应有明显的颜色区别；
待检血清与特异性抗原反应的A值≥0.2；
待检血清与特异性抗原反应的A值/阴性血清与特异性抗原反应的A值≥2.1。
若均不符合上述条件，判为阴性；仅满足1-2条者判为可疑，需用同一种方法或另一种方法重试。
四、技术特点与优势高灵敏度与特异性：ELISA可检测低水平抗体，减少漏诊风险。
高通量检测：适用于大规模样本筛查，提高检测效率。
操作标准化：通过严格的质量控制（如对照设置、试剂配制、孵育条件）确保结果可靠性。
结果量化：通过A值定量分析，减少主观判断误差。
五、与其他方法的对比间接血凝试验（IHA）：操作简便，但敏感性较低，易受非特异性凝集素干扰，通常作为初筛方法。
免疫荧光试验（IFA）：可直接观察抗原-抗体反应，但需荧光显微镜，操作复杂。
PCR检测：灵敏度极高，可检测弓形虫DNA，但需专业设备和技术人员，成本较高，通常作为确诊手段（GB/T 中列为附录A）。