农药登记毒理学试验方法 小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验GB 15670-1995 14.6第三方检测机构

GB 《农药登记毒理学试验方法》中14.6部分详细规定了小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验的方法与要求，该试验旨在评估农药对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，通过检测受试物引起小鼠睾丸精母细胞染色体畸变的效应，预测其遗传危害和潜在致癌作用的可能性。

一、试验原理

雄性生殖细胞从精原细胞发育成成熟精子需要经过多个发育阶段，不同发育阶段的雄性生殖细胞对化学物质的敏感性不同。初级精母细胞对化学诱变比较敏感，在哺乳动物精子发生过程中，DNA合成是在初级精母细胞细线期以前的各阶段细胞中进行，以后发育的细胞不再进行DNA合成。受试物需在前细线期给予，于小鼠第一次接触受试物后的第12~14天采样制片，可以观察到前细线期接触引起的精母细胞染色体畸变效应。

二、试验动物与分组

动物选择：选用6~8周龄健康雄性小鼠，每组应保证至少有5只存活小鼠。

分组设计：

阴性对照组：使用等体积的溶剂。

阳性对照组：使用已知具有诱变作用的物质，如丝裂霉素C（1.5~2mg/kg，腹腔注射一次）或环磷酰胺（40mg/kg，腹腔注射，每天1次，连续5天）。

受试物组：设3个剂量组，根据急性LD50，选用可使动物出现轻中毒症状、体重略有下降、不引起动物死亡的剂量为高剂量，按2~3倍组间间距设中、低剂量组。

三、试验方法

受试物接触方法：受试物接触途径应与实际接触途径一致或接近，可采取一次接触或每天1次、连续5天的方法。

取样时间：各组均于第一次接触受试物后第12~14天将动物处死制片。

制片步骤：

动物处死前处理：处死前6小时腹腔注射秋水仙素（4mg/kg，0.04%秋水仙素按0.1ml/10g体重给予）。

睾丸取出与处理：以颈椎脱臼法处死小鼠，取出两侧睾丸，去净周围组织和脂肪，用低渗液洗去毛和血污后，放入盛有适量低渗液的小平皿中。

低渗处理：用眼科镊撕开睾丸被膜，轻轻分离曲精管，加低渗液至8~10ml，室温下低渗20~40分钟（低渗时间视室温条件而定）。

固定处理：仔细吸尽低渗液，加固定液10ml，固定20分钟。必要时可存放在冰箱中过夜，但软化前应将固定液吸掉，再加入新鲜配制的固定液，固定10分钟。

软化与离心：吸尽固定液，加60%冰醋酸1~2ml，待大部分曲细精管软化后立即加入倍量的固定液，用吸管打匀，移入离心管，以1000r/min离心10分钟。

制片：弃去大部分上清液，留下约0.5~1.0ml，充分打匀制成细胞混悬液。将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上，每个样本制片2~3张。

染色与观察：用1:10Giemsa染液（pH6.8）染色20~40分钟，立即用蒸馏水或pH6.8的磷酸缓冲液冲洗，晾干后放入片盒中保存。

四、观察指标与结果判定

观察指标：主要观察染色体畸变类型，包括裂隙、断片、微小体、相互易位、X-Y和常染色体的单价体等。

结果判定：

统计学分析：对每个动物记录含染色体结构畸变的细胞数和每个细胞的染色体畸变数，按二项分布进行统计学分析。

阳性结果判定：剂量组染色体畸变率与阴性对照组相比有显著性差异（P