食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验GB 4789.14-2014第三方检测机构，食品安全国家标准国标检测

GB 4789.14-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检验方法，包括平板计数法和MPN计数法，以下是对该标准的详细解读：

一、适用范围

该标准适用于食品中蜡样芽胞杆菌的检验，包括各类食品中蜡样芽胞杆菌的计数和鉴定。

二、检验方法1. 平板计数法

适用情况：适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品。

检验程序：

样品处理：冷冻样品应在45℃以下不超过15分钟或在2℃~5℃不超过18小时解冻；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃~5℃冰箱保存，24小时内检验。

样品制备：称取样品25g，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液（PBS）或0.85%生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以8000r/min~10000r/min均质1分钟~2分钟，或放入盛有225mL PBS或0.85%生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1分钟~2分钟。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL PBS或0.85%生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀，作为1:10的样品匀液。

样品稀释：吸取1:10的样品匀液1mL加到装有9mL PBS或0.85%生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1:100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

样品接种：根据对样品污染状况的估计，选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别移入三块甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂平板，用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃~50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

培养：涂布后，将平板静置10分钟。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30℃±1℃培养1小时，等样品匀液吸收后翻转平板，倒置于培养箱，30℃±1℃培养24小时±2小时。如果菌落不典型，可继续培养24小时±2小时再观察。在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有白色至淡粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶）。

可疑菌株分离、纯化：从每个平板中挑取至少5个典型菌落（小于5个全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30℃±1℃培养24小时±2小时，进行确证实验。在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4mm~10mm。

染色镜检：挑取纯培养的单个菌落，革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌，大小为（1μm~1.3μm）×（3μm~5μm），芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。

生化鉴定：挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、V-P试验、葡萄糖利用（厌氧）试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验等确证试验。

结果计算：选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU~200CFU之间的平板，计数典型菌落数。根据稀释倍数计算每克（或每毫升）样品中蜡样芽胞杆菌的数量。

2. MPN计数法

适用情况：适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品。

检验程序：该法结合了增菌和生化鉴定步骤，通过统计阳性管数，查MPN表得出每克（或每毫升）样品中蜡样芽胞杆菌的最可能数（MPN）。

三、注意事项

样品采集：应确保样品的代表性，避免污染。

培养基制备：应严格按照标准要求制备培养基，确保质量。

操作规范：检验过程中应严格遵守无菌操作规范，避免交叉污染。

结果判定：应结合菌落形态、染色镜检和生化鉴定结果进行综合判定。

四、限量要求

我国现行《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》（GB 31607-2021）规定：

第一类（制作过程中，所有组分均经彻底加热处理，存储后销售的散装即食食品）和第二类（制作过程中，加入了未彻底加热处理组分或生鲜组分，经或未经存储后销售的散装即食食品）中以米为主要原料制作的食品中蜡样芽胞杆菌不得超过10000CFU/g（mL）。

香港《即食食品微生物含量索引》和澳门《即食食物的微生物含量判定指引》均规定一般即食食品中蜡样芽胞杆菌不得超过100000CFU/g，满意范围为小于1000CFU/g。

国际上，澳大利亚和新西兰的即食食品微生物限量标准规定蜡样芽胞杆菌和其他致病性芽胞杆菌不得超过10000CFU/g，满意范围为小于100CFU/g。