Rab3蛋白 纽斯特

免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。

2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。

将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：50?1000（取决于样品中Arf 6蛋白质的量）新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或过夜4oC。

3.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

4.将膜与二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶联物）一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。

5.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

6.使用您选择的检测方法，例如ECL。

测定步骤

I.主动Arf 6下拉分析

1.将0.5 – 1 mL细胞裂解液等分到微量离心管中。

2.使用1X分析/裂解缓冲液将每个样品的体积调整为1 mL。

3.在管中加入1 μl抗活性Arf 6单克l隆抗l体。

4.通过涡旋或滴定彻底重悬蛋白A / G琼脂糖珠浆。

5.快速向每个管中添加20 μL重悬浮的珠浆。

6.轻轻搅拌将试管在4°C下孵育1小时。

7.通过以5，Rab3蛋白，000 x g离心1分钟来沉淀小珠。

8.吸出并丢弃上清液，确保不要干扰/除去珠粒。

9.用0.5 mL的1X Assay / Lysis Buffer洗涤磁珠3次，每次离心并吸出。

10.后一次洗涤后，将珠粒沉淀并小心除去所有上清液。

11.将磁珠沉淀重悬于20 μL 2X还原SDS-PAGE样品缓冲液中。

12.将每个样品煮沸5分钟。

13.以5，000 x g的速度离心每个样品10秒钟。

1. VASP通过调节Rab11依赖性TGF-β受体的质膜靶向来促进肝星状细胞的TGF-β活化

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2. Rab5活性调节GLUT4分类为胰岛素反应性和非胰岛素反应性内体室：胰岛素抵抗发展的潜在机制。

内分l泌学。 2014年9月; 155（9）：3315-28

将裂解液转移到适当大小的试管中，并置于冰上。

如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。 如果发生这种情况，可将裂解液通过27?号注射l器针头3-4次以剪切基因组DNA。

通过离心10分钟（在4°C下为12，000 x g）清除裂解物。

收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-70°C以便将来使用。

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